Western blot實(shí)驗(yàn)過程中常見問題匯總及處理方案。

21、想分離的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？濃縮膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？

答：分離膠用7％，濃縮膠 3.5％，200kd的蛋白不好做。

22、如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？

答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30％是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試1.5mm的。

23、蛋白變性后可以存放多久？

答：－80℃，一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。

24、我所測定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？

答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?/span>105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。

25、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？

答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用ＢＳＡ代替?yīng)該好一點(diǎn)．

26、問一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？

答：Western Blot一般上樣30－100ug不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長短有關(guān)。開始摸條件時(shí)，為了拿到陽性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。

27、做組織樣品的western的時(shí)候，怎樣處理樣品？

答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。

28、問大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠最好選擇7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。

29、有什么方法可以提高上樣量？

答：a)可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量；b)用5倍的上樣緩沖液來稀釋變性

30、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？

答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等，如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超載。

31、一抗，二抗的比例是否重要？

答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。

32、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

答：對(duì)二抗無要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。

33、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。

34、Western Blot 中抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？

答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。

35、在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。

36、檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？

答：可以。

37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？

答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢， 你延長轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡。

38、做Western Blot時(shí)，同樣的抗體免疫組化能做出，而Western Blot卻不能？

答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和免疫組化。

39、如果是6×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？

答：一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為3－5ml。

40、上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果。

答：無特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過一兩次的緩沖液。